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5 Design von Presenilin1-Inhibitoren durch Asparaginsäureaktivierung

5.4 Biologische Aktivität & Inhibitoreigenschaften

Die Unbeständigkeit der Cyclopropylmethyl-Motive der Verbindungen 149-154

gegenüber einer säurekatalysierten Ringumlagerung (Schema 5.2) fällt in der

Reihenfolge ihrer Stabilität der Carbokationen 151, 153 > 149 > 150 >> 152, 154.

Testexperimente in DCM und der Gegenwart variierender Konzentrationen von

Essigsäure und TFA zeigen dieselbe Reihenfolge für die Säurelabilität der Ester-

Funktionen. Bei einer Konzentration von 10% TFA wurden die Verbindungen 149-

151 und Verbindung 153 innerhalb von 30 Minuten gespalten. Die Kontrollsubstanz

154 blieb unter diesen Bedingungen dagegen stabil.

Die γ-Sekretase-Aktivität aller Verbindungen (außer Verbindung 152) wurde mittels

de novo Produktion von AICD (APP intracellular domain) in vitro verfolgt. Nach einer

Vorschrift von Kornilova et al. konnten mit der Schwedischen Mutante veränderte

Membranbruchstücke von HEK-29 Zellen hergestellt werden.

[253]

Nach Inkubation

dieser Zellen mit den entsprechenden Verbindungen 144 und 149-154 (außer 152)

sowie DAPT und dem Inhibitor L-685,458 und anschließender Ultrazentrifugation

wurden die löslichen Fragmente mittels SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate

polyacrylamide gel electrophoresis) aufgetrennt und durch einen Immunoblot mit

dem Antikörper 6687 nachgewiesen.

[254]

SDS-PAGE ist eine Variante der Gelelektrophorese, einer analytischen Methode zur

Auftrennung von Molekülen im elektrischen Feld. Als Trennmedium der

Elektrophorese dient ein Gel auf Polyacrylamidbasis, im vorliegenden Fall ein „Tris-

Tricine“-Gel der Firma Invitrogen. Zusätzlich kommt SDS zum Einsatz. Dieses

anionische Detergens überdeckt die Eigenladungen der Proteine. Die so

aufgetrennten Proteine werden über eine Immunodetektion mit dem Antikörper 6687

detektiert.

Die Auswertung der biologischen Tests zeigt ein unterschiedliches Verhalten der

einzelnen Verbindungen. Bei der Diazoverbindung 144 sowie der Kontrollsubstanz

154 konnte bis zu Konzentrationen von 100 µM keinerlei AICD-Hemmung

nachgewiesen werden. Dagegen zeigen die Substanzen 149-151 inhibitorische

Eigenschaften im nanomolaren Bereich. Bei der Bestimmung zuverlässiger IC

Werte und einer damit verbundenen aussagekräftigen Rangfolge der verschiedenen

Verbindungen treten allerdings Schwierigkeiten auf. Ursache könnte ein

zeitabhängiger Inhibitionsmechanismus infolge einer irreversiblen Alkylierung der

Aspartate sein. Warum die säurelabile Verbindung 153 allerdings weniger aktiv

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